液体クロマトグラフィーによる定量分析の原理と方法

液体クロマトグラフィーの分離メカニズムは、混合物中の 2 つの相に対する成分の親和性の違いに基づいています。

さまざまな固定相に応じて、液体クロマトグラフィーは、液体-固体クロマトグラフィー、液体-液体クロマトグラフィー、および結合相クロマトグラフィーに分類されます。最も広く使用されているのは、充填剤としてシリカゲルを使用する液体-固体クロマトグラフィーと、マトリックスとしてマイクロシリカを使用する結合相クロマトグラフィーです。

固定相の形態に応じて、液体クロマトグラフィーはカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーに分類できます。吸着能力に応じて、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィーに分類できます。

近年、液体カラムクロマトグラフィーシステムに高圧液流システムが追加され、高圧下で移動相を急速に流すことで分離効果が向上し、高効率（高圧とも呼ばれる）液体クロマトグラフィーが普及しています。が現れた。

一部
01 液体クロマトグラフィーの定量分析の原理

定性的に定量するには、標準物質として純粋な物質が必要です。

液体クロマトグラフィーの定量化は比較的定量的な方法です。つまり、混合物中の分析物の量は、既知の量の純粋な標準サンプルから推定されます。

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02 液体クロマトグラフィーによる定量の基礎

測定された成分の量 (W) は応答値 (A) (ピーク高さまたはピーク面積) に比例します (W=f×A)。

定量補正係数（f）：定量計算式の比例定数であり、物理的意味は単位応答値（ピーク面積）で表される測定成分の量です。

定量的補正係数は既知の標準試料量とその応答値から求めることができます。

未知成分の応答値を測定し、定量的な補正係数によりその成分の量を求めることができます。

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03 定量分析の共通用語

サンプル (サンプル): クロマトグラフィー分析用の分析対象物を含む溶液。標準サンプルと未知サンプルに分けられます。

標準: 濃度が既知の純粋な製品。未知のサンプル (未知): 濃度をテストする混合物。

サンプル重量: テストするサンプルの元の重量。

Dilution: 未知のサンプルの希釈係数。

成分 : 定量的に分析されるクロマトグラフィーのピーク、つまり内容が不明な分析物。

成分量（量）：被験物質の含有量（または濃度）。

整数性: コンピューターによってクロマトグラフィーのピークのピーク面積を測定する計算プロセス。

検量線: 成分含有量対応答値の直線曲線。既知量の標準物質から確立され、分析物の未知の含有量を決定するために使用されます。

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04 液体クロマトグラフィーの定量分析

1. 定量分析に適したクロマトグラフィー方法を選択します。

l 検出成分のピークを確認し、分解能(R)1.5以上を実現

l 試験した成分のクロマトグラフィーのピークの一貫性 (純度) を決定します。

l メソッドの検出限界と定量限界を決定します。感度と直線範囲

2. 異なる濃度の標準サンプルを使用して検量線を作成します。

3. 定量的手法の精度と精度をチェックする

4. 対応するクロマトグラフィー管理ソフトウェアを使用して、サンプル収集、データ処理、結果のレポートを実行します。

一部
05 定量的ピークの特定（定性的）

定量化する各クロマトグラフィーのピークを定性的に識別します

まず、標準サンプルを使用して、定量するクロマトグラフィーのピークの保持時間 (Rt) を決定します。保持時間を比較することで、未知のサンプルの各クロマトグラフィー ピークに対応する成分を見つけます。クロマトグラフィーの定性的方法では、保持時間を標準サンプルと比較します。基準が不十分さらなる確認（定性的）

1. 標準添加方法

2. 他のメソッドを同時に使用する: 他のクロマトグラフィーメソッド (別のクロマトグラフィーカラムを使用するなど、メカニズムを変更する)、他の検出器 (PDA: スペクトル比較、スペクトルライブラリ検索、MS: 質量スペクトル分析、スペクトルライブラリ検索)

3. その他の手段および方法

一部
06 定量的ピークの一貫性の確認

クロマトグラフィーのピークの一貫性 (純度) を確認する

各クロマトグラフィー ピークの下に測定成分が 1 つだけ存在することを確認します。

共溶出物質（不純物）による干渉の有無を確認

クロマトグラフィーのピークの一貫性 (純度) の確認方法

スペクトログラムとフォトダイオード マトリックス (PDA) 検出器の比較

ピーク純度の識別

2996 純度角理論

PART 07でよく使われる定量的手法

標準曲線法、外部標準法と内部標準法に分けられます。

1. 外部標準法: 液体クロマトグラフィーで最もよく使用されます。

既知の濃度の一連の標準サンプルは、標準サンプルとして試験される化合物の純粋サンプルを使用して調製されました。応答値 (ピーク面積) までカラムに注入されます。
ある範囲内では、標準サンプルの濃度と応答値の間に良好な直線関係、つまり W= f×A が存在し、検量線が作成されます。

全く同じ実験条件で未知のサンプルを注入し、測定対象成分の応答値を取得します。既知の係数 f に基づいて、測定対象の成分の濃度を求めることができます。

外部標準法の利点:操作と計算が簡単で、一般的に使用される定量的な方法です。各成分を検出して溶出する必要はありません。標準サンプルが必要です。標準サンプルと未知サンプルの測定条件が一致している必要があります。注入量は正確でなければなりません。

外部標準法の欠点:検出器の感度、流量、移動相の組成は変更できないなど、高い実験条件が要求されます。各注入量は良好な再現性を持つ必要があります。

2. 内部標準法: 正確ですが面倒で、標準的な方法で最もよく使用されます。

既知量の内部標準を標準に添加して混合標準を作成し、既知の濃度の一連の作業標準を調製します。混合標準中の標準と内部標準のモル比は変わりません。クロマトグラフィーカラムに注入し、（標準サンプルのピーク面積/内部標準サンプルのピーク面積）を応答値として取得します。応答値と作業標準濃度の間の線形関係、つまり W= f×A に従って、標準曲線が作成されます。

既知量の内部標準を未知のサンプルに加えてカラムに注入し、測定対象成分の応答値を取得します。既知の係数 f に基づいて、測定対象の成分の濃度を求めることができます。

内部標準法の特徴:操作中、サンプルと内部標準物質が混合されてクロマトグラフィーカラムに注入されるため、混合溶液中の測定成分と内部標準物質の量の比率が一定である限り、サンプルの体積の変化は起こりません。定量的な結果には影響しません。。内部標準法はサンプル量、さらには移動相や検出器の影響を相殺するため、外部標準法よりも正確です。

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08 定量分析結果に影響を与える要因

精度の低下は次の原因で発生する可能性があります。

不正確なピーク面積積分、サンプル調製中に混入したサンプルの分解または不純物、密封されていないサンプルバイアル、サンプルまたは溶媒の揮発、不正確なサンプル前処理、サンプル注入の問題、不正確な内部標準調製

精度が低い場合に考えられる理由は次のとおりです。

不正確なピーク積分、注入またはインジェクターの問題、サンプルの分解またはサンプル調製中に混入した不純物、クロマトグラフィーの問題、検出器の応答の低下