原料、中間体、製剤、包装材料中の各成分の含有量や不純物を検査する主な方法は液体クロマトグラフィーですが、多くの物質には信頼できる標準的な方法がないため、新たな方法の開発が避けられません。液相法の開発においては、クロマトグラフィーカラムが液体クロマトグラフィーの中核となるため、適切なクロマトグラフィーカラムを選択する方法が重要です。この記事では、液体クロマトグラフィーカラムの選び方を全体の考え方、考慮事項、適用範囲の3つの観点から解説します。
A.液体クロマトグラフィーカラム選定の全体的な考え方
1. 分析対象物の化学構造、溶解度、安定性（酸化・還元・加水分解しやすさなど）、酸性・アルカリ性などの物理的・化学的性質を評価します。特に化学構造が重要です。共役基は紫外線吸収が強く、蛍光が強いなど、物性を決定する要因。
2. 分析の目的を決定します。高分離、高カラム効率、短い分析時間、高感度、高耐圧、長いカラム寿命、低コストなどが必要かどうか。
- 適切なクロマトグラフィー カラムを選択します。クロマトグラフィー フィラーの組成、物理的および化学的特性 (粒径、細孔径、温度耐性、pH 耐性、分析物の吸着など) を理解します。
- 液体クロマトグラフィーカラムを選択する際の考慮事項
この章では、クロマトグラフィーカラム自体の物理的および化学的特性の観点から、クロマトグラフィーカラムを選択する際に考慮すべき要素について説明します。 2.1 フィラーマトリックス
2.1.1 シリカゲルマトリックス ほとんどの液体クロマトグラフィーカラムの充填マトリックスはシリカゲルです。このタイプのフィラーは、高純度、低コスト、高い機械的強度を備え、基 (フェニル結合、アミノ結合、シアノ結合など) の修飾が容易ですが、許容される pH 値と温度範囲が制限されています。ほとんどのシリカゲル マトリックス フィラーの pH 範囲は 2 ～ 8 ですが、特別に修飾されたシリカゲル結合相の pH 範囲は 1.5 ～ 10 まで広く、低 pH で安定な特別に修飾されたシリカゲル結合相もあります。 Agilent ZORBAX RRHDsteadybond-C18 など、pH 1 ～ 8 で安定です。シリカゲルマトリックスの温度上限は通常 60 ℃ ですが、一部のクロマトグラフィー カラムは高 pH で 40 ℃ の温度に耐えることができます。
2.1.2 ポリマーマトリックス ポリマーフィラーは主にポリスチレン-ジビニルベンゼンまたはポリメタクリレートです。その利点は、広い pH 範囲に耐えられることです。1 ～ 14 の範囲で使用でき、高温に対する耐性がより高い (80 °C 以上に達する可能性があります)。シリカベースの C18 フィラーと比較して、このタイプのフィラーは疎水性が強く、マクロ多孔質ポリマーはタンパク質などのサンプルの分離に非常に効果的です。欠点は、シリカ系充填剤に比べてカラム効率が低く、機械的強度が弱いことです。 2.2 粒子の形状
最新の HPLC フィラーのほとんどは球状粒子ですが、不規則な粒子である場合もあります。球状粒子は、カラム圧力を低くし、カラム効率を高め、安定性を高め、寿命を長くすることができます。高粘度の移動相 (リン酸など) を使用する場合、またはサンプル溶液が粘性である場合、不規則な粒子の比表面積が大きくなり、2 つの相の完全な作用がより促進され、価格が比較的低くなります。 2.3 粒子サイズ
粒子径が小さいほどカラム効率は向上し、分離性能は向上しますが、耐高圧性は低下します。最も一般的に使用されるカラムは、粒子サイズ 5 μm のカラムです。分離要件が高い場合は、1.5 ～ 3 μm のフィラーを選択できます。これは、一部の複雑なマトリックスや多成分サンプルの分離問題の解決に役立ちます。 UPLC では 1.5 μm のフィラーを使用できます。セミ分取カラムまたは分取カラムには、粒径 10 μm 以上のフィラーがよく使用されます。 2.4 炭素含有量
炭素含有量とは、シリカゲル表面の結合相の割合を指し、比表面積と結合相の被覆率に関係します。炭素含有量が高いと、カラム容量が高く、分離能が高く、高度な分離が必要な複雑なサンプルによく使用されますが、2 相間の相互作用時間が長いため、分析時間が長くなります。低炭素含有量のクロマトグラフィー カラムは分析時間が短く、さまざまな選択性を示すことができ、迅速な分析を必要とする単純なサンプルや高い水相条件を必要とするサンプルによく使用されます。一般に、C18 の炭素含有量は 7% ～ 19% の範囲です。 2.5 細孔径と比表面積
HPLC 吸着媒体は多孔質粒子であり、ほとんどの相互作用は細孔内で起こります。したがって、吸着および分離するには、分子が細孔に入らなければなりません。
細孔サイズと比表面積は、2 つの相補的な概念です。細孔径が小さいことは比表面積が大きいことを意味し、その逆も同様です。比表面積が大きいと、サンプル分子と結合相の間の相互作用が増加し、保持力が向上し、サンプルローディングとカラム容量が増加し、複雑な成分が分離されます。完全多孔質フィラーは、このタイプのフィラーに属します。高い分離要件がある場合は、比表面積の大きなフィラーを選択することをお勧めします。比表面積が小さいと背圧が低減され、カラム効率が向上し、平衡時間が短縮されるため、グラジエント分析に適しています。コアシェルフィラーはこのタイプのフィラーに属します。高い分析効率が要求されるフィラーについては、確実な分離を前提として比表面積の小さいフィラーを選択することをお勧めします。 2.6 細孔容積と機械的強度
「細孔容積」としても知られる細孔容積は、単位粒子あたりの空隙容積のサイズを指します。フィラーの機械的強度をよく反映します。細孔容積の大きなフィラーの機械的強度は、細孔容積の小さなフィラーに比べて若干弱くなります。細孔容積が 1.5 mL/g 以下のフィラーは主に HPLC 分離に使用され、細孔容積が 1.5 mL/g を超えるフィラーは主に分子排除クロマトグラフィーや低圧クロマトグラフィーに使用されます。 2.7 キャッピングレート
キャッピングにより、化合物と露出したシラノール基の間の相互作用 (アルカリ性化合物とシラノール基の間のイオン結合、ファンデルワールス力、酸性化合物とシラノール基の間の水素結合など) によって引き起こされるテーリングピークを低減できるため、カラム効率とピーク形状が向上します。 。キャップのない結合相は、特に極性サンプルの場合、キャップのある結合相とは異なる選択性をもたらします。
- さまざまな液体クロマトグラフィーカラムの適用範囲
この章では、さまざまな種類の液体クロマトグラフィーカラムの適用範囲をいくつかの事例を通して説明します。
3.1 逆相 C18 クロマトグラフィーカラム
C18 カラムは最も一般的に使用される逆相カラムで、ほとんどの有機物質の含有量および不純物検査に適合し、中極性、弱極性、および無極性物質に適用できます。 C18 クロマトグラフィー カラムのタイプと仕様は、特定の分離要件に従って選択する必要があります。たとえば、高い分離要件がある物質の場合は、5 μm*4.6 mm*250 mm の仕様がよく使用されます。複雑な分離マトリックスと同様の極性を持つ物質の場合は、4 μm*4.6 mm*250 mm 仕様またはそれより小さい粒子サイズを使用できます。たとえば、著者は 3 μm*4.6 mm*250 mm カラムを使用して、セレコキシブ API に含まれる 2 つの遺伝毒性不純物を検出しました。 2 つの物質の分離は 2.9 に達する可能性があり、これは優れています。また、確実な分離を前提として、迅速な分析が必要な場合には10mmや15mmの短いカラムが選択されることが多いです。たとえば、著者が LC-MS/MS を使用してリン酸ピペラキン API の遺伝毒性不純物を検出する場合、3 μm*2.1 mm*100 mm カラムを使用しました。不純物と主成分の分離は2.0であり、サンプルの検出は5分で完了します。 3.2 逆相フェニルカラム
フェニルカラムも逆相カラムの一種です。このタイプのカラムは芳香族化合物に対して強い選択性を持っています。通常の C18 カラムで測定した芳香族化合物の応答が弱い場合は、フェニルカラムの交換を検討してください。例えば、セレコキシブ原薬を作成した際、同じメーカー、同じ仕様のフェニルカラム（いずれも5μm×4.6mm×250mm）で測定した主成分応答は、C18カラムの約7倍でした。 3.3 順相カラム
逆相カラムの効果的な補足として、順相カラムは極性の高い化合物に適しています。逆相カラムで 90% 以上の水相で溶出するときにピークが依然として非常に速く、溶媒のピークに近く、重なっている場合は、順相カラムの交換を検討できます。このタイプのカラムには、ヒリックカラム、アミノカラム、シアノカラムなどが含まれます。
3.3.1 Hilic カラム Hilic カラムは通常、結合したアルキル鎖に親水基を埋め込んで、極性物質に対する応答を強化します。糖類の分析に適したカラムです。著者は、キシロースとその誘導体の含有量と関連物質を調べるときにこのタイプのカラムを使用しました。キシロース誘導体の異性体も十分に分離できます。
3.3.2 アミノカラムとシアノカラム アミノカラムとシアノカラムは、特殊な物質の選択性を向上させるために、結合したアルキル鎖の末端にそれぞれアミノ修飾とシアノ修飾を導入することを指します。たとえば、アミノカラムは良い選択です。糖、アミノ酸、塩基、アミドの分離用。シアノカラムは、共役結合の存在により、構造類似物質の水素化物と非水素化物を分離する際の選択性が優れています。アミノカラムとシアノカラムは順相カラムと逆相カラムを切り替えることができますが、頻繁に切り替えることはお勧めできません。 3.4 キラルカラム
キラルカラムはその名の通り、特に医薬品分野におけるキラル化合物の分離・分析に適しています。従来の逆相カラムおよび順相カラムでは異性体の分離ができない場合に、このタイプのカラムを検討できます。たとえば、著者は 5 μm * 4.6 mm * 250 mm のキラル カラムを使用して、1,2-ジフェニルエチレンジアミンの 2 つの異性体 (1S, 2S)-1, 2-ジフェニルエチレンジアミンと (1R, 2R)-1, 2 を分離しました。 -ジフェニルエチレンジアミンであり、両者間の分離は約 2.0 に達しました。ただし、キラルカラムは他のタイプのカラムよりも高価で、通常は 1 W 以上/本です。このような柱が必要な場合には、十分な予算を確保する必要があります。 3.5 イオン交換カラム
イオン交換カラムは、イオン、タンパク質、核酸、一部の糖物質などの荷電イオンの分離と分析に適しています。フィラーの種類に応じて、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、強陽イオン交換カラムに分類されます。
陽イオン交換カラムにはカルシウム系カラムと水素系カラムがあり、主にアミノ酸などの陽イオン物質の分析に適しています。たとえば、著者はフラッシング溶液中のグルコン酸カルシウムと酢酸カルシウムを分析する際にカルシウムベースのカラムを使用しました。両方の物質は λ=210nm で強い応答を示し、分離度は 3.0 に達しました。著者は、グルコース関連物質を分析する際に水素ベースのカラムを使用しました。いくつかの主要な関連物質 (マルトース、マルトトリオース、フルクトース) は、差動検出器で高い感度を示し、検出限界は 0.5 ppm と低く、分離度は 2.0 ～ 2.5 でした。
陰イオン交換カラムは、主に有機酸やハロゲンイオンなどの陰イオン物質の分析に適しています。強陽イオン交換カラムは、より高いイオン交換容量と選択性を備えており、複雑なサンプルの分離と分析に適しています。
上記は、いくつかの一般的な液体クロマトグラフィー カラムの種類と適用範囲を、著者自身の経験と組み合わせて紹介したものにすぎません。実際の用途では、大細孔クロマトグラフィー カラム、小細孔クロマトグラフィー カラム、アフィニティー クロマトグラフィー カラム、マルチモード クロマトグラフィー カラム、超高速液体クロマトグラフィー カラム (UHPLC)、超臨界流体クロマトグラフィー カラムなど、他の特殊なタイプのクロマトグラフィー カラムもあります ( SFC）など、さまざまな分野で活躍しています。特定の種類のクロマトグラフィー カラムは、サンプルの構造と特性、分離要件、その他の目的に応じて選択する必要があります。
投稿日時: 2024 年 6 月 14 日